Background
研究背景
髓样细胞是高度异质性的，具有不同的个体发生和免疫功能。髓样细胞群，包括单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，在中枢神经系统（CNS）功能稳态中的不同作用日益被认识。大脑边界，包括硬脑膜，承载着大量的髓样细胞池，它们介导中枢神经系统的免疫监视。在损伤和神经炎症过程中，髓样细胞浸润中枢神经系统，并显示出与小胶质细胞（中枢神经系统固有的巨噬细胞）不同的功能。了解CNS边界和CNS实质在稳态和受侵扰过程中的髓系免疫细胞的发育，对于我们理解CNS病变后免疫反应的基本机制以及设计针对神经系统疾病的治疗方法至关重要，这些神经系统疾病包括损伤、慢性神经退行性疾病、中枢神经系统感染和脑肿瘤。
01
Objective
研究目的
髓样细胞是中枢神经系统功能的重要贡献者，但这些细胞在中枢神经系统边界的起源以及在炎症或神经退行性疾病条件下迁移到中枢神经系统实质的途径尚不清楚。在某些情况下——例如，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）或中枢神经系统损伤后的单核细胞浸润——髓系细胞起到保护和病理作用。作者认为这些异质性功能可能代表不同的细胞起源，并试图研究髓样细胞浸润的来源以及它们进入受损或发炎脑脊髓实质的途径。此前有文献报道，在中风时，连接颅骨骨髓和硬脑膜的通道允许中性粒细胞迁移。因此，作者探讨了这些通道和颅骨骨髓细胞巢是否也允许在稳态和CNS疾病小鼠模型中维持脑硬膜髓样池。作者进一步将他们的观察扩展到脊椎骨髓细胞巢，作为硬脊膜髓样细胞的潜在来源。
02
Results
研究结果
中枢神经系统边界有大量非血液来源的单核细胞和中性粒细胞
为了了解稳定状态下边界髓样细胞的起源，作者将人类泛素C启动子后连接绿色荧光蛋白（UBC-GFP）的转基因小鼠和野生型（WT）小鼠的循环系统进行了共生性联接，使宿主和荧光供体来源的细胞能够可视化，并在配对60天后，可以用流式细胞术分析对血液，脑相关组织（硬脑膜和硬脊膜）、造血器官（颅骨骨髓、脊椎骨髓和股骨骨髓）和外周对照组织（脾脏和肝脏）（图1，A-C）。为了确保我们的分析只检查真正的脑脊髓实质细胞群体而不被血液污染，小鼠在安乐死前2分钟接受静脉注射抗CD45抗体，该抗体标记血液和血管相关白细胞，随后在我们的流式检测中排除（图1B）。对野生型共生体的分析表明，尽管总CD45+细胞在血液中的嵌合性达到了50:50的比例（图S1A），但无论是中性粒细胞还是单核细胞在血液中都没有达到完美的嵌合性。2个月后，GFP:WT细胞比率达到约30:70（图1、D和E）。这些髓样细胞嵌合性的减少可能是由于这些细胞的半衰期短以及骨髓中发生的活跃的骨髓生成。
尽管Ly6C+单核细胞和中性粒细胞的血液嵌合体不完善，但在硬脑膜和硬脊膜中检测到的GFP+细胞比例明显低于血液（图1、D和E）。相比之下，在其他外周组织中显示的髓样嵌合体更接近血液中的比例（图1、D和E）。这些数据表明，在大脑边缘有大量的单核细胞和中性粒细胞，而这些单核细胞和中性粒细胞并非来源于UBC-GFP共生体。来自UBC-GFP共生体硬脑膜和硬脊膜的CD4T细胞与血液嵌合体没有显著差异，表明其主要是血液来源与之前文献一致（图1F）。此外，GFP+Ly6c?单核细胞和B细胞在不同的组织中表现出不同程度的嵌合性。GFP+B细胞在大脑边缘的特异性表达似乎较少，这也表明是非血液来源（图S1、B和C）。这一现象在另一篇文稿中有更详细的描述。与非边界相关的脾细胞池相比，硬膜髓样单元的其他成分，包括巨噬细胞、传统树突状细胞（cDC）1s和cDC2s，也显示出较低比例的GFP+细胞（图S1，D至F）。对几个骨髓巢的分析证实，大多数检测到的LSK（谱系?SCA-1+c-Kit?)造血祖细胞为GFP?细胞，如预期来自活跃的WT增殖细胞巢（图S1G）。我们通过免疫组织化学（IHC）证实了这些流式细胞术数据，并证明了WT宿主组织中仅有一小部分GFP+CCR2+和GFP+Ly-6B.2+细胞（图1G）。使用CD45.1和CD45.2小鼠配对形成共生体，作者也观察到与之前UBC-GFP和WT共生体相似的不平衡性，即与血液嵌合性相比，硬脑膜中宿主来源的嵌合性单核细胞和中性粒细胞比例很低，表明观察到的结果在不同的共生体之间是一致的（图S1、H和I）因此，大量非血液来源的单核细胞和中性粒细胞似乎分布在硬脑膜和硬脊膜上。
接下来，作者研究了硬膜是否含有能够维持局部单核细胞库的单核细胞祖细胞。使用流式细胞术，可以有效地识别颅骨骨髓中的单核-树突状细胞祖细胞（MDPs）和单核细胞定向祖细胞（cMoPs）。然而，这些细胞群在颅骨硬膜中完全缺失（图S1，J至S）。为了排除Ly6C+单核细胞和中性粒细胞在硬膜中低水平的嵌合性归因于组织中这些细胞的增殖和自我更新的可能性，作者使用由泛髓系启动子LysM驱动的三苯氧胺(他莫昔芬)诱导命运图Cre重组酶系统来表达荧光蛋白ZsGreen（图1H），研究这些髓系细胞的转换。在连续三天注射他莫昔芬后，血单核细胞和中性粒细胞的重组效率分别达到36%和87%。30天后，几乎没有检测到循环中的绿色细胞（图1，I至K）。值得注意的是，在所有研究的时间点上，血液的命运图绘制效率与硬膜中的结果一致，表明血液和硬膜间隙中骨髓单核细胞的半衰期相似（图1，H至K；图S2，A至D）。为了排除单核细胞和中性粒细胞的未标记部分提供局部自我维持组织驻留细胞池的可能性，我们进行了体内5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EdU）标记和Ki67染色。对血液、颅骨硬膜和颅骨骨髓的分析证实，在两次EdU注射后24小时，硬膜中的大多数Ly6C+单核细胞和中性粒细胞结合了EdU，但显示出低水平的Ki67（图S2，E-J）。因此，这些细胞似乎来源于一个增殖源，但可能在这些组织中经历了快速转换，并且在骨髓巢之外的增殖能力较低。而且，硬膜中性粒细胞显示出与颅骨骨髓池相同的EdU结合水平，而血液中性粒细胞几乎完全没有EdU+细胞，这表明硬膜的中性粒细胞可能来自附近的骨髓（图S2，E至J）。最后，我们研究了硬膜Ly6c+单核细胞和中性粒细胞池是否利用脑脊膜淋巴管从组织中流出。为此，我们使用带有KikGreen的转基因小鼠，其带有KikGreen到KikRed的光转换荧光蛋白。尽管最终光转换24小时后，引流的颈深淋巴结中存在中性粒细胞和Ly6C+单核细胞，但与未转换的对照组相比，颈深淋巴结中的KikRed细胞没有显著差异（图S2，K至N）。因此，硬膜中Ly6C+单核细胞和中性粒细胞的补充似乎来源于局部，而不是为了维持组织本身或血液内的稳态。
图1.中枢神经系统边界含有大量非血液来源的单核细胞和中性粒细胞。
颅骨骨髓为大脑边缘提供髓样细胞
通过包含血管的从颅骨骨髓延伸到硬脑膜的骨化通道的直接连接，使中性粒细胞和肿瘤细胞可以在炎症或病理状态下迁移。先前的中性粒细胞追踪策略是向颅骨骨髓中注射以标记脑浸润细胞。然而，在尝试对骨髓来源的稳态硬膜髓样细胞进行评估时，作者发现这种方法不适合我们的目的，因为它导致示踪剂立即泄漏到硬脑膜中，并随后通过脑脊膜淋巴管排出（图S3，A-N）。尽管这些直接骨髓注射的教训，但作者发现，通过变薄的颅骨对颅骨骨髓短暂局部应用CXCR4拮抗剂AMD可促进髓样细胞的排出。这导致下层硬脑膜中Ly6C+单核细胞和中性粒细胞显著增加，而不改变血液、肺或其他骨髓巢中的比例，表明其直接从局部颅骨骨髓迁移（图2，A-E）。在AMD给药24小时后，研究者没有观察到颅骨骨髓中髓样细胞数量的变化。这可能是由于浸润硬脑膜的单核细胞和中性粒细胞数量仅占CNS相关骨髓巢的一小部分。
这些数据促使作者仔细研究颅骨骨髓是脑膜髓样细胞来源的可能性。因此，作者开发了一种颅骨瓣移植，其中从UBC-GFP小鼠移植了一块含有大量骨髓库的颅骨（~6mm×4mm），以覆盖在硬脑膜完好的但有相似大小颅骨缺损的WT小鼠头部（图2F）。移植后7天和30天对移植的颅骨瓣进行的IHC分析显示，GFP+骨髓持续存在，尽管一些部位部分由非GFP表达细胞重新填充（图2G和图S4、A和B）。与无菌损伤诱导的硬膜血管生成一致（27），血管重塑在第7天观察到，但在30天后恢复到原始小鼠的覆盖范围（图2H和图S4、C和D）。移植的骨瓣包含颅骨修复所需的颅骨缝。事实上，1个月后，移植骨与WT小鼠的头骨融合在了一起（图S4E和movieS1）。作者在移植的颅骨瓣下硬膜中检测到GFP+细胞，包括CCR2+单核细胞、IBA1+巨噬细胞和CD31+血管系统（图S4、F和G）。血液、颅骨硬膜和颅骨骨髓的流式细胞术分析证实，尽管移植颅骨骨髓巢中的GFP+细胞供体池较少，但即使在移植后30天，它仍能产生硬膜Ly6C+单核细胞和中性粒细胞（图2，I-M；以及图S4，H和I）。为了证明从移植颅骨到硬膜的髓样浸润的直接途径，作者观察了先前描述的连接移植颅骨与硬脑膜的血管通道（图S4、J和K；以及movieS2和S3）。通过Sholl分析，在30天后，对底层皮质的分析显示小胶质细胞没有激活（图S4、L和M），并且在移植后初始体重减轻后，小鼠又恢复到正常体重，表明使用该模型的慢性干扰最小（图S4N）。
接下来，作者采用放疗方案，进一步排除共生或颅骨瓣移植策略后观察到的表型是炎症驱动的可能性（图2N）。小鼠接受致死性照射，并采用不同的屏蔽策略，然后用UBC-GFP来源的骨髓进行骨髓重建。正如预期的那样，身体受照射的小鼠的硬脑膜Ly6C+单核细胞和中性粒细胞显示出与颅骨骨髓相似的嵌合性水平。两个部位的嵌合性明显低于血液和股骨骨髓中的嵌合性（图2，O-Q）。头部受到辐射的小鼠显示出相反的效果，与血液或股骨骨髓相比，颅骨骨髓和硬脑膜中的GFP+细胞比例显著更高（图2、R和S）。
为了探索能够招募骨髓源性髓样细胞的硬膜来源的因子，我们使用来自全硬脑膜单细胞RNA测序（scRNAseq）分析的RNA-magnet算法，以无偏倚地确定单核细胞和中性粒细胞趋化因子受体的配体表达（图S5、A和B）。然后，我们对整个硬膜匀浆进行半定量趋化因子蛋白表达分析，以确认预测配体是否真实存在（图S5C）。我们确定了CCL2、CCL12和CCL8的高表达，它们可以通过CCR2信号招募单核细胞，以及CCL6，其可以通过CCR1招募中性粒细胞。这表明稳态硬膜包含适当信号，可以招募邻近骨髓的髓样细胞（图S5，C至E）。因此，在稳态条件下，分布在大脑边缘的髓样细胞巢接收来自颅骨骨髓的大量输入，而颅骨骨髓似乎是髓样细胞的关键分配器。这提供了一个健康组织承载髓样细胞的例子，这些髓样细胞的持续补充并不是以血液作为主要途径。
图2.颅骨骨髓为大脑边缘提供髓样细胞。
发炎的CNS被血液和其邻近的骨髓源性髓样细胞浸润
由于硬脑膜中存在大量非血源性单核细胞和中性粒细胞，作者推测这些细胞可能在发生实质性CNS损伤时处于快速反应的位置。我们继续在三种CNS损伤模型中使用共生配对研究这种情况：实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）、脊髓损伤和视神经挤压损伤。对于EAE实验，将WT和UBC-GFP小鼠共生联接60天，并用完全Freud佐剂中的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽（35-55）（MOG35-55）免疫两组以诱导EAE。EAE诱导后15天，从WT共生体收集腰髓、腰椎骨髓、硬脊膜和血液，并进行流式检测和IHC染色（图3A和图S6、A和B）。与它们在稳态时一致，在硬膜和CNS中浸润的大量Ly6c+单核细胞并非来源于血液，因为与血液嵌合体相比，它们的GFP+比例显著降低（图3、B和C）。有趣的是，中性粒细胞、CD4T细胞和Ly6C-单核细胞并没有观察到同样的情况，表明此时血液是这些浸润细胞的主要来源（图3D和图S6，C-E）。硬膜和脊髓GFP+巨噬细胞也被观察到了，这表明浸润性单核细胞在这些炎症条件下可以分化，但数量不足以解释嵌合体差异（图S6F）。与流式细胞术分析一致，硬脑膜、硬脊膜和脊髓的IHC显示WT组织中浸润的GR1+细胞很少为GFP+（图3E）。在硬脑膜中，GR1+细胞主要与硬脑膜窦相关，作者观察到腔内淋巴定位的证据，表明在神经炎性疾病期间髓样细胞有淋巴转运的可能性，如之前文献报道一致（图S6，G-I）。
在CD45.1-CD45.2共生体脊髓损伤后，与血液相比，CNS浸润的Ly6C+单核细胞（但不包括中性粒细胞、CD4T细胞或Ly6C?单核细胞）在脊髓和硬脊膜中的宿主来源细胞比例也显著降低，这表明存在局部骨髓来源（图S7，A-G）。存在GFP+单核细胞来源的巨噬细胞，但其在受损脊髓中的比例较低（图S7H）。另一种CNS损伤也获得了类似的结果，与血液的嵌合性相比，WT-UBC-GFP共生体在视神经挤压后，浸润视神经的Ly6C+单核细胞和中性粒细胞的供体来源细胞的比例显著偏低（图S7，I至L）。重要的是，在使用耳皮肤穿刺的外周损伤模型中未观察到相同的情况，该模型缺乏局部骨髓库，在损伤部位显示出的髓系细胞的嵌合性与在血液中观察到的结果相似（图S7，M-P）。
为了确定非血源性单核细胞侵入脊髓组织的直接途径，作者就椎骨中是否也存在类似颅骨中的骨髓通道进行了探索。诱导后15天，苏木精-伊红（HE）染色和IHC显示在野生和EAE小鼠中均存在直接连接脊椎骨髓和硬脊膜的通道，且这些通道内存在细胞（图3F和图S8，A至C）。此外，作者发现GR1+细胞的脊髓浸润现象经常与这些骨髓-硬脊膜通道的存在相关（图3F）。虽然这些通道的确切解剖结构仍有争议，但目前已发现这些通道止点位于硬脑膜内，并未直接接触CNS组织（图3F和图S8，A至E）。尽管髓系细胞穿过下方的蛛网膜和软脑膜进入CNS实质的确切机制尚待研究，但作者推测在神经炎症环境下，这些由紧密连接组成的屏障很有可能与血脑屏障一样会被破坏。
接下来，作者试图确定不同来源的CNS浸润单核细胞（即血液来源、骨髓来源或脑膜来源）是否因为进入CNS的途径不同而具有不同的表型。使用WT–UBCGFP联体小鼠诱导EAE15天后，从WT小鼠脊髓中分离浸润的GFP+和GFP-IV-CD45?CD45hi细胞并进行scRNA序列分析（图S9，A至C）。分选出的大多数细胞是单核细胞，但也有中性粒细胞、树突状细胞（DC）、B细胞、T细胞、小胶质细胞和巨噬细胞，以及一群种类不明的增殖性细胞群，该群中既有GFP+也有GFP-细胞（图3、G和H）。与先前的EAE实验一致，GFP?细胞大部分是单核细胞，这一现象与其非血液来源是吻合的（图3I和图S9C）。对GFP+与GFP-单核细胞的基因差异表达生物学过程进行基因本体通路分析，发现GFP+单核细胞中涉及阴离子和脂质转运的代谢通路及伤口愈合相关通路均表达下调（图3J和表S1）。表达上调的通路则主要涉及白细胞迁移、粘附和T细胞活化（图3K和表S1）。对差异表达基因的分析显示，诱导后GFP+单核细胞大量产生多种髓系细胞和淋巴细胞趋化因子（Ccl2、Ccl5、Cxcl9和Cxcl16）和促炎细胞因子（Il6、Il1a、Il1b、Tnf和Ifng）（图3L和表S2）。这些数据表明，在EAE小鼠体内，相较骨髓来源的单核细胞，血液来源的单核细胞有着显著的的促炎倾向，这与最近发表的研究显示神经炎症疾病中存在CXCL10+/CXCL9+这一单核细胞致病亚群的现象相符。这些细胞可能通过CCL5-、CXCL9-和CXCL16-介导的T细胞募集及生成促炎细胞因子促进白细胞迁移，而这些都是EAE发病机制中的关键因素。
值得注意的是，对脊髓损伤3天后的WT联体小鼠脊髓中浸润的IV-CD4?CD45hiGFP+及GFP?单核细胞的scRNA-seq分析表明，血源性GFP+单核细胞中与白细胞迁移和激活相关的通路有类似的表达上调，同时有几种趋化因子和细胞因子表达小范围上调（图S9，D至L；表S3和S4）。因此，血液和骨髓来源的单核细胞在不同CNS损伤和炎症环境下可能具有不同的作用，正如脊髓损伤时脉络丛单核细胞和经血液迁移单核细胞有着不同的作用一样。
图3.发炎的中枢神经系统被血液和中枢神经系统邻近的骨髓源性髓样细胞浸润。
03
Conclusion
结论
本篇的研究结果表明，在稳态或中枢神经系统损伤或神经炎症疾病后，邻近大脑和脊髓的骨髓细胞巢向硬脑膜提供单核细胞。此外，作者还证明了CNS边界来源的髓样细胞可以在损伤和炎症条件下通过脑膜屏障迁移到实质中。在CNS损伤和神经炎症模型中，与血液来源的髓样细胞相比，CNS边界来源的髓样细胞表现出更少的炎症和更多的调节表型。因此，这些细胞可能在其他情况下（如中枢神经系统感染和脑肿瘤时）调节免疫反应——很可能是负性调节——中发挥关键作用。了解脑边界来源的髓样细胞在生理和病理情况下，在中枢神经系统免疫监测中的功能，可能有助于开发神经系统疾病的治疗方式。
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